本试剂盒采用升级版ARMS技术:本产品基于扩增阻滞突变系统PCR (Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR)进行技术改良,实现样本检测的高敏感性、高特异性和低经济负担。相比于一代测序具有更高的灵敏度优势;相比ddPCR可以降低假阳性严重误导。
本试剂盒基于实时PCR平台,结合等位基因特异性扩增(ARMS)技术和野生型基因扩增抑制技术检测 BRAF 基因 V600E 突变。ARMS 技术是指 PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板 DNA互补才能有效扩增。通过设计特异性ARMS 引物,并在引物3’末端的第二个碱基引入错配以提高引物延伸的特异性防止发生错配,对存在 V600E 突变的 BRAF 基因靶序列进行 PCR扩增放大,并利用 FAM 基因标记的 Taqman 探针对扩增产物进行检测。另外采用野生型基因扩增抑制技术,利用block 封闭探针封闭野生型 BRAF 基因,使ARMS体系能够耐受更高浓度的背景野生型 BRAF 基因,提高检测灵敏度。同时本试剂盒在反应体系中引入 UDG 防污染系统,包括 dUTP 和 UDG 酶组分。在 PCR 反应中以 dUTP 替代 dTTP 掺入 DNA 中,形成了含 dU 碱基的 PCR 扩增产物,UDG 酶能选择性断裂单链和双链 DNA 中 dU 碱基的糖苷键,降解含 dU 的 PCR 扩增产物。天然的、未经修饰的 DNA 不含 dU,不受 UDG 酶影响,可继续作为PCR扩增的模板进行扩增。